Genetická onemocnění jsou stále globální výzvou, protože jsou způsobena mutacemi v genech, které ovlivňují biologické funkce, metabolické procesy nebo produkci určitých esenciálních proteinů jedinců, až po různé dědičné poruchy. Léky pro genovou terapii jsou typem terapeutického zásahu, který se zaměřuje na specifické geny s cílem je opravit nebo modifikovat a poskytnout buňkám nové pokyny k produkci funkčních proteinů nebo zásahu do genových defektů, které způsobují onemocnění.
Mezi běžné genové léky patří především DNA a RNA, kde DNA mohou být genové fragmenty nebo genové sekvence s terapeutickými účinky. Tyto DNA jsou dodávány do buněk, aby nahradily nebo doplnily defektní nebo chybějící genové funkce. RNA může být messenger RNA (mRNA), malá interferující RNA (siRNA) nebo antisense oligonukleotidy (ASO) atd., které mohou být použity k modifikaci, inhibici exprese škodlivých genů nebo obnovení funkce specifických genů.
DNA i RNA však čelí mnoha problémům od vstupu do lidského těla až po dosažení cílových buněk. Protože genové sekvence jsou v gastrointestinálním traktu nestabilní, jsou obvykle podávány intravenózní nebo subkutánní injekcí, ale i tak je většina genových sekvencí stále degradována hojnými nukleázami v lidském těle.
Když se malé množství zbytkových genových léků dostane ven z cílových buněk, nemohou vstoupit do buněk, protože genové sekvence jsou velké molekuly s fosfátovými skupinami nesoucími negativní náboje, zatímco buněčné membrány také nesou negativní náboje. Když se setkají dva záporné náboje, geny se odpuzují a nemohou vstoupit do buněk. Proto potřebujeme vyvinout specifické metody dodávání genových léků, abychom zabránili jejich degradaci in vivo a zlepšili účinnost penetrace buněčnou membránou a hladce dopravili sekvence DNA nebo RNA do buněk.
Způsoby dodávání genových léků
Současné běžné metody přenosu genů se dělí hlavně do dvou kategorií: dodání virového vektoru a dodání nevirového vektoru. Doručení virového vektoru zahrnuje zejména adeno-asociovaný virus (AAV) a lentivirus atd., které mohou simulovat proces virové infekce hostitelských buněk a snadno procházet buněčnou bariérou, čímž se dosahuje vysoké účinnosti doručení. Doručování virového vektoru má však také problémy: za prvé má omezenou kapacitu balení, jako je maximální kapacita balení AAV 4,7 kb, což nemůže dodat delší genové sekvence; za druhé, virové vektory mohou způsobit vážné imunitní reakce, včetně buněčné imunity a humorální imunity, což představuje riziko pro klinické aplikace. Ve srovnání s tím mají ne-virové vektory obrovské výhody v bezpečnosti a kapacitě naložení léčiva.
Současné běžně používané ne{0}}virové vektory zahrnují především liposomy, polymery, nanočástice, exozomy atd., mezi nimiž jsou lipozomy vezikuly tvořené amfifilními molekulami o průměrech od 100 nm do 1 um. Skládají se hlavně z fosfolipidů, cholesterolu, PEG lipidů a kationtových lipidů. Struktura fosfolipidové dvojvrstvy je podobná buněčným membránám a může do buněk hladce vstupovat endocytózou. Kromě toho mohou lipozomy také modifikovat PEG nebo specifické protilátky na jejich površích, aby unikly imunitní clearance těla a zároveň se zaměřily na specifické tkáně nebo buňky. Kationtové lipozomy jsou lipozomy, které obsahují kladně nabité lipidy kvartérní amoniové soli, které se mohou lépe vázat s léčivy na bázi záporně nabitých nukleových kyselin a udržovat stabilitu dodávacího systému. Proto jsou lipozomy jednou z běžných ne{9}}virových metod dodávání vektorů pro genová léčiva.
Tradiční liposomy však mají také určité problémy: zaprvé, kvůli velkému rozpětí průměrů liposomů, ačkoli to může zajistit dostatečnou kapacitu naplnění léčiva, když lipozomy projdou vaskulární endoteliální mezerou (100-200nm), příliš velká velikost bude bránit tomuto procesu. Navíc poté, co lipozomy vstoupí do buněk endocytózou a vytvoří systém endozom-lysozom, tradiční lipozomy nemohou dokončit lysozomální únik včas, což má za následek, že většina genových léků je degradována lysozomy a není schopna uplatnit své účinky. Na základě těchto nedostatků tradičních lipozomů při dodávání genových léků byly vyvinuty lipidové nanočástice (LNP), které se staly důležitou metodou dodávání zvláště vhodnou pro dodávání nukleových kyselin do cílových buněk a tkání.
Úvod do nosného systému LNP
Lipidové nanočástice (LNP) jsou nanočástice složené z lipidových -látek o průměru obecně mezi 10–200 nm. Ve srovnání s tradičními lipozomy jsou menší a snadněji procházejí vaskulárními endoteliálními mezerami. Kromě toho se LNP obvykle skládá z kationtových/ionizovatelných lipidů, pomocných fosfolipidů, polyethylenglykolových (PEG) lipidů a cholesterolu. Mezi nimi mohou pomocné fosfolipidy a cholesterol zvýšit stabilitu LNP; PEG lipidy pomáhají prodloužit dobu cirkulace LNP in vivo a snížit imunitní reakce. Tyto složky mají podobné funkce jako tradiční lipozomy. Rozdíl spočívá v kationtových/ionizovatelných lipidech, které jsou také hlavní oblastí patentové ochrany LNP.
Jak bylo zmíněno dříve, kationtové lipozomy mohou účinně udržovat vazbu s léčivy na bázi nukleové kyseliny a zlepšit účinnost dodávání léčiv na bázi nukleové kyseliny. Kationtové lipozomy jsou však také náchylné k ne-specifické vazbě s negativně nabitými plazmatickými proteiny, krevními buňkami atd. v tělesném oběhu, což způsobuje agregaci liposomů a je rychle odstraněno z těla (polo-životnost kationtových lipozomů in vivo je pouze 15 minut).
K vyřešení tohoto problému výzkumníci vyvinuli nový typ lipidového materiálu nazývaného ionizovatelné lipidy. Ionizovatelné lipidy jsou svou strukturou velmi podobné kationtovým lipidům. Vezmeme-li jako příklady běžný kationtový lipid DOTAP a ionizovatelný lipid DODAP, rozdíl je v tom, že DOTAP je kvartérní amoniová sůl s kladným nábojem, zatímco DODAP je struktura terciárního aminu. Struktura terciárního aminu může udržovat pKa lipidu mezi 6-7. Když je pH nižší než pKa (za kyselých podmínek), ionizovatelné lipidy jsou kladně nabité.
Když je pH blízké pKa (za neutrálních podmínek), ionizovatelné lipidy jsou neutrální. Tento design může chytře vyřešit problém, se kterým se setkávají kationtové lipozomy: protože pH v krevním oběhu je blízké neutrálnímu, ionizovatelné lipidy jsou také neutrální a nespecifická vazba mezi nimi a plazmatickými proteiny nebo krvinkami je výrazně snížena, což prodlužuje poločas-životnosti. Kromě toho, když jsou ionizovatelné lipidy LNP absorbovány buňkami a vstupují do lysozomů, jsou lipidy ionizovány a pozitivně nabity v lysozomálním prostředí s pH 5-6. Kladně nabité lipidy jsou snadno fúzovány s membránou endozom-lysozom, což umožňuje lipozomům uniknout do cytoplazmy, disociovat a uvolňovat nukleové kyseliny, čímž se uplatňují jejich účinky. Stručně řečeno, návrh nosného systému LNP zahrnuje optimalizaci složení lipidů, velikosti částic, povrchového náboje a stability pro dosažení účinného dodání genu.
Strategie bioanalýzy LCMS pro genová léčiva-zabalená do LNP
LNP-zabalené genové léky se skládají hlavně z obalu LNP a samotného genového léku. Skořápka LNP se skládá převážně z lipidových složek (kationtové/ionizovatelné lipidy tvoří asi 30-50 %, PEG lipidy asi 2 %, cholesterol asi 20-50 %, pomocné fosfolipidy asi 10-20 %), zatímco genová léčiva se skládají převážně z fragmentů genové sekvence (DNA, ASO, siRNA a miRNA atd.). Podle nejnovějších předpisů NMPA a FDA[14-15] jsou pro IND aplikaci léků v systému podávání léků, jako je LNP, kromě provádění farmakologických a farmakokinetických studií na aktivní složce (sekvence genů), bezpečnost a farmaceutické hodnocení také pro nové lipidové složky, které nebyly použity v lécích na trhu v systému podávání léků, jako jsou speciální modifikace kationtových a lipidů LNP se speciálními lipidy LPEG.
LCMS bioanalýza LNP lipidů se zaměřuje na kationtové/ionizovatelné lipidy a PEG lipidy. Vzhledem ke strukturním rozdílům mezi nimi je molekulová hmotnost kationtového/ionizovatelného lipidu obecně do 1 kDa, zatímco molekulová hmotnost PEG lipidu může dosáhnout 2~5 kDa poté, co nese modifikační skupiny, což vede k velkým rozdílům v chromatografické retenci a odezvě hmotnostní spektrometrie mezi nimi. Vzhledem k tomu, že obsah kationtového/ionizovatelného lipidu v LNP je vyšší než v PEG lipidu, vede rozdíl v odezvách k neschopnosti efektivně sjednotit metody předúpravy (výběr extrakčního rozpouštědla, stanovení faktoru ředění) obou. Navíc, kvůli přítomnosti mnoha interferujících píku kolem polohy píku PEG lipidu, je pro účinnou separaci často vyžadován delší separační gradient kapalné fáze, který nemůže zaručit vysokou účinnost analýzy. Proto jsme samostatně zavedli metodu detekce PEG lipidů v bioanalýze. Současně mají kationtové/ionizovatelné lipidy a PEG lipidy také společné obtíže při vývoji metody kvůli jejich lipidovým složkám, jako je špatná rozpustnost ve vodě, nestabilita v biologické matrici, vazba proteinu na výtěžnost překračující limit, vysoká interference a rezidua PEG lipidu, změna stability lipidu v matrici skutečného vzorku a obtížnost výběru vnitřního standardu.
